稀釋法是體外定量測定抗菌藥物抑制待測菌生長活性的方法。根據稀釋培養基的不同，分為肉湯稀釋法和瓊脂稀釋法。瓊脂稀釋法是細菌藥敏試驗的金標準。稀釋法所測得的某抗菌藥物抑制待測菌生長的最低濃度為最低抑菌濃度（MIC），稀釋法也可測定最小殺菌濃度（MBC）。

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    稀釋法測定原理

    以水解酪蛋白（M-H）液體培養基將抗菌藥作不同濃度的稀釋，然后接種待測菌，定量測定抗菌藥物抑制該菌的最低濃度（MIC）或殺死該菌的最低（或最小）殺菌濃度（MBC）。

    稀釋法測定材料

    （1） 抗菌藥物原液的配制：配制各種抗菌藥物原液的溶劑一般為蒸餾水、磷酸鹽緩沖液或乙醇等，穰釋劑多為蒸餾水。配制時需用標準粉劑并了解其效力（效價），用下列公式計算配制抗菌藥物原液一定濃度所需要標準粉劑的毫克數。

    A：稱取標準粉劑的毫克數

    B：稀釋劑的毫升數

    C：貯存液的濃度（即原液濃度，U/ml或μg/ml）

    D：標準粉劑的有效力（即效價，U/mg或μg/mg）

    最后，原液以過濾法除菌，小量分裝使用。大部分抗菌藥物原液在-20℃以下可保存三個月，而在4℃以下只能保存一周。

    （2）培養基：一般細菌采用M-H液體培養基；鏈球菌和嗜血桿菌屬除培養基為液體外，其他需補充的成分均同K-B法。

    （3）接種菌液的制備：在已分純的待測菌平板上挑取4～5個形態相同的菌落接種于3～5ml M-H液體培養基內，35℃培養4～6h；鏈球菌屬和嗜血桿菌屬的細菌需接種于含血液的M-H液體培養基，35℃培養過夜，校正菌液濃度，使其相當于0.5麥氏比濁標準，再用M-H液體培養基按1：200稀釋后備用。稀釋后的菌液應在15min內接種。

    稀釋法實驗步驟

    （1）排列試管10～15支，除第一支外，每管加人M-H液體培養基lml。

    （2）先吸取抗菌藥物原液（1000μg/ml）5.12ml加入液體4.88m1中，混合，吸出分別加入第一管和第二管中，每管1ml，第二管經混合后吸出1ml，加入第三管中，依次類推至第十五管后，吸出1ml棄去，這樣各管抗菌藥物的最終含量依次為512、256、128、64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25、0.13、0.06、0.03μg/ml。另設培養液對照，檢測菌生長對照和質控菌生長對照管各一支。

    （3）將已校正濃度的待測菌懸液依次加入含藥管內，每管0.05ml，混勻。各試管置35℃培養12～18h后觀察結果。每次以同法作對照菌的藥敏試驗。

    稀釋法結果判讀：

    最低抑菌濃度（MIC）：凡無肉眼可見細菌生長的藥物最低濃度即為該待測菌MIC。

    最低殺菌濃度（MBC）：再以0.01ml容量接種環取肉眼觀察認為無菌生長的試管移種一環于血瓊脂平板作次代培養，經35℃培養過夜后觀察最低藥物濃度能殺死99.9%原始種入的細菌即為該菌的MBC。

    稀釋法影響結果的因素

    （1）培養基：培養基的pH、滲透壓及電解質對MIC和MBC均有影響。

    （2）抗菌藥物：抗菌藥物必須采用標準粉劑。配好的藥物原液應在有效期內使用。

    （3）結果觀察時間：16～18h觀察，有的細菌在20～24h觀察。培養時間過長，被輕度抑制的部分細菌可重新開始生長；另外由于某些抗菌藥物不夠穩定，培養時間過長使其抗菌活性降低，甚至消失，從而使MIC值增高。

    稀釋法測定質量控制

    每次實驗時應根據待測菌的不同而分別選用：金黃色葡萄球菌ATCC25923、大腸埃希菌ATCC25922、糞腸球菌ATCC29212和銅綠假單胞菌ATCC27853等標準菌株在同-試驗條件下作平行試驗，常用抗菌藥物對這些標準菌株的MIC應在預期值范圍內。超過或低于預期值范圍一個稀釋度以上，不應向臨床發出報告，應檢查出現差錯的原因以及標準菌株被污染和變異的可能性。

    稀釋法殺菌試驗

    臨床實驗室常用的定量評價抗菌藥物殺菌效力的試驗主要包括最低殺菌濃度（MBC）試驗和殺菌曲線法。

    ①最低殺菌濃度　最低殺菌濃度是某抗菌藥物能殺滅99.9%以上的測試菌量的最低藥物濃度。測定方法就是稀釋法MIC測定的基礎上通過再轉種、再孵育，最終測得某種抗菌藥物對被測菌的MBC。

    ②時間-殺菌曲線 時間-殺菌曲線主要用于評價一種抗菌藥物對測試菌的殺菌速率，以及兩種或兩種以上抗菌藥物對測試菌的聯合殺菌活性。操作時培養基和測試菌的準備等與測定MIC的肉湯稀釋法相同，設定0h、4h、8h、24h等不同培養時間的試驗管，對每個管均設立生長對照管，每個試驗管在到達孵育時間后，立即連同生長對照管轉種血平板進行菌落計數。最后將各時間點測得的平均菌落計數在半對數坐標紙上繪制殺菌曲線。